62/2000 Protect the health of infants and young children! Wanyi ion chromatography determines seven types of human mil

Lời nói đầu

Oligosaccharides từ sữa mẹ (HMOs) là một nhóm các oligosaccharides có bậc trùng hợp không quá 3, có mặt tự nhiên trong sữa mẹ; chúng là thành phần rắn lớn thứ ba trong sữa mẹ, sau lactose và chất béo. Chúng điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột — đặc biệt thúc đẩy sự xâm chiếm của Bifidobacteriaceae trong ruột trẻ sơ sinh — đồng thời duy trì sức khỏe đường ruột, hỗ trợ sự phát triển miễn dịch và não bộ, và có tác dụng chống nhiễm trùng, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của trẻ sơ sinh. Kể từ khi công thức sữa bột cho trẻ sơ sinh được bổ sung HMO đầu tiên ra mắt tại Hoa Kỳ vào năm 2015, một loạt các loại sữa bột cho trẻ sơ sinh, các sản phẩm từ sữa, thực phẩm bổ sung hỗ trợ tiêu hóa và thực phẩm chức năng chứa HMO đã được bán trên toàn thế giới. Tính đến ngày 1 tháng 6 năm 2023, Hoa Kỳ và EU đã phê duyệt bảy loại HMO để sử dụng: 2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, difucosyllactose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-tetraose, 3'-sialyllactose và 6'-sialyllactose.

Trong số các phương pháp phát hiện HMO phổ biến, sắc ký lỏng yêu cầu phản ứng dẫn xuất trước khi phát hiện, liên quan đến việc chuẩn bị mẫu phức tạp và các thuốc thử dẫn xuất thường độc hại; bản chất nhạy cảm với nhiệt của HMO cũng dẫn đến phản ứng thấp và độ lặp lại kém trong LC-MS. Ngược lại, sắc ký ion với phát hiện ampe cho carbohydrate mang lại việc chuẩn bị mẫu đơn giản, phản ứng cao và độ lặp lại tốt, mang lại lợi thế rõ ràng cho việc phân tích HMO. Ghi chú ứng dụng này sử dụng dung dịch natri hydroxit, natri axetat và nước siêu tinh khiết được chuẩn bị thủ công làm dung dịch rửa giải, và sử dụng máy sắc ký ion WAYEAL IC6300 để xác định HMO trong sữa bột cho trẻ sơ sinh. Phương pháp này có đặc điểm là chuẩn bị mẫu đơn giản, độ nhạy cao và độ tuyến tính tốt, cung cấp tài liệu tham khảo hữu ích cho việc phát hiện HMO trong thực phẩm.

Từ khóa: máy sắc ký ion; oligosaccharides từ sữa mẹ; máy dò ampe.

1. Thiết bị, Dụng cụ và Hóa chất

1.1 Hóa chất và Chuẩn

Bảng 1. Danh sách hóa chất và chuẩn

1.2 Vật liệu phòng thí nghiệm và Thiết bị phụ trợ

• 1.2.1 Cân phân tích (độ chính xác 0,1 mg);
• 1.2.2 Bể nước ổn nhiệt;
• 1.2.3 Máy ly tâm;
• 1.2.4 Màng lọc polyethersulfone (PES) trong nước (0,45 µm);
• 1.2.5 Nước siêu tinh khiết;
• 1.2.6 Thiết bị lọc chân không;
• 1.2.7 Cột tiền xử lý chiết pha rắn (SPE) RP;
• 1.2.8 Xi lanh dùng một lần (20 mL, 5 mL).

2. Phương pháp thực nghiệm

2.1 Chuẩn bị dung dịch

• 2.1.1 Dung dịch natri hydroxit 200 mmol/L: Hút chính xác 10,5 mL dung dịch NaOH 50%, pha loãng với nước đến 1000 mL và lọc chân không.
• 2.1.2 Dung dịch hỗn hợp NaOH 75 mmol/L và natri axetat 250 mmol/L: Cân chính xác 20,51 g natri axetat, hòa tan trong nước và chuyển vào bình định mức 1000 mL; hút chính xác 3,95 mL dung dịch NaOH 50%, pha loãng đến 1000 mL bằng nước siêu tinh khiết và lọc chân không.
• 2.1.3 Dung dịch axit sulfosalicylic 3%: Cân 3,0 g axit sulfosalicylic, hòa tan trong nước và pha loãng đến 100 mL (chuẩn bị tươi).
• 2.1.4 Dung dịch gốc chuẩn hỗn hợp: Cân chính xác 5 mg mỗi loại 2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, lacto-N-tetraose và lacto-N-neotetraose (đến 0,1 mg gần nhất), cho vào bình định mức 10 mL, hòa tan trong nước và pha loãng đến vạch để chuẩn bị dung dịch gốc hỗn hợp 500 mg/L. Cân riêng 1 mg difucosyllactose (đến 0,1 mg gần nhất), cho vào bình định mức 10 mL, hòa tan và pha loãng đến vạch để chuẩn bị dung dịch gốc 100 mg/L.
• 2.1.5 Dung dịch làm việc chuẩn hỗn hợp: Hút chính xác dung dịch gốc hỗn hợp (2.1.4) vào các bình định mức và pha loãng với nước để chuẩn bị dung dịch làm việc hỗn hợp 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT và DFL ở các nồng độ 0,5, 2, 4, 6, 8 và 10 mg/L. Chuẩn bị tươi trước khi sử dụng.

2.2 Chuẩn bị mẫu

Cân khoảng 2,0 g mẫu cho vào cốc nhỏ, trộn đều với 50 mL nước ấm (khoảng 50 °C), thêm 40 mL dung dịch axit sulfosalicylic 3%, chuyển vào bình định mức và pha loãng đến 100 mL, và siêu âm trong 10 phút. Lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (12.000 vòng/phút, 15 phút). Cho dung dịch mẫu đi qua cột SPE RP và sau đó là màng lọc nước 0,45 µm; loại bỏ 3 mL đầu tiên và thu dịch rửa giải để phân tích. Trước khi sử dụng, điều kiện hóa cột SPE RP với 20 mL methanol sau đó là 15 mL nước, và cân bằng trong 30 phút.

2.3 Điều kiện thực nghiệm

2.3.1 Điều kiện sắc ký ion

3. Kết quả

3.1 Khoảng tuyến tính

Một lượng thích hợp của mỗi dung dịch làm việc chuẩn hỗn hợp đã được phân tích. Khoảng tuyến tính là 0,5–10 mg/L; độ lệch giữa nồng độ đo được và nồng độ danh định nằm trong giới hạn sai số cho phép tối đa, giá trị R² đều lớn hơn 0,999 và tất cả các thành phần đều cho thấy độ tuyến tính tốt.

Bảng 2. Khoảng tuyến tính của các hợp chất

Hình 1. Sắc ký hiệu chuẩn chồng chéo của bảy chuẩn HMO

3.2 Kết quả kiểm tra mẫu

Mẫu 1 và 2 được kiểm tra sau khi pha loãng 10 lần. Hàm lượng của từng loại HMO trong bảy loại được tính như sau: X là hàm lượng trong mẫu (mg/100g); c là nồng độ trong dung dịch mẫu từ đường cong hiệu chuẩn (mg/L); V là thể tích không đổi (mL); m là khối lượng mẫu (g); f là hệ số pha loãng. Hàm lượng tính toán (mg/100g) như sau:

Hình 2. Sắc ký đồ của Mẫu 1 pha loãng 10 lần

Hình 3. Sắc ký đồ của Mẫu 2 pha loãng 10 lần

Bảng 3. Kết quả kiểm tra mẫu

3.3 Độ chính xác

Dung dịch làm việc ở cấp hiệu chuẩn thứ tư được phân tích trong sáu lần tiêm liên tiếp dưới các điều kiện trong 2.3.1. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của hàm lượng bảy loại HMO đã được tính toán để đánh giá độ lặp lại. Kết quả dưới đây cho thấy độ chính xác phương pháp tốt.

3.3.1 Độ chính xác lặp lại của chuẩn

Kết quả kiểm tra:

Hình 4. Sắc ký đồ chồng chéo của các lần tiêm lặp lại độc lập của chuẩn hiệu chuẩn S4

Bảng 4. Độ chính xác lặp lại của chuẩn

3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

LOD: Các phần dung dịch chuẩn được pha loãng thành dung dịch hỗn hợp chứa 10 µg/L 3'-FL, 30 µg/L DFL, 30 µg/L 2'-FL, 22 µg/L LNnT, 67 µg/L LNT, 67 µg/L 6'-SL và 160 µg/L 3'-SL; 20 mẫu song song đã được chuẩn bị và phân tích.

LOQ: Các phần dung dịch chuẩn được pha loãng thành dung dịch hỗn hợp chứa 30 µg/L 3'-FL, 80 µg/L DFL, 90 µg/L 2'-FL, 65 µg/L LNnT, 200 µg/L LNT, 200 µg/L 6'-SL và 500 µg/L 3'-SL; sáu mẫu song song đã được chuẩn bị và phân tích.

Kết quả kiểm tra như sau:

Bảng 5. Kết quả S/N cho LOD và LOQ của bảy loại HMO

3.5 Độ đặc hiệu

Các phần (mỗi phần 100 µL) dung dịch chuẩn glucose, fructose, sucrose và maltose đã được thêm vào bình định mức 10 mL và pha loãng đến vạch bằng dung dịch Mẫu 2 pha loãng 67 lần. Dung dịch được phân tích để kiểm tra xem các loại đường này có gây nhiễu cho các đỉnh của bảy loại HMO hay không. Như thể hiện dưới đây, bốn loại đường không cho thấy sự can thiệp đáng kể nào đối với việc xác định bảy loại HMO trong sữa bột.

Hình 5. Sắc ký đồ chồng chéo của chuẩn hiệu chuẩn S6, Mẫu 2 và Mẫu 2 được bổ sung bốn chuẩn đường

4. Kết luận

Việc xác nhận này đã sử dụng máy sắc ký ion WAYEAL để xác minh phương pháp xác định HMO trong thực phẩm. Dữ liệu cho thấy tất cả các đỉnh sắc ký đều có hình dạng tốt mà không bị kéo đuôi; 2'-FL, 3'-FL, DFL, LNnT, LNT, 6'-SL và 3'-SL đều rửa giải trong vòng 60 phút; độ nhạy đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn quốc gia; và hệ số tương quan tuyến tính đều lớn hơn 0,999. Độ lặp lại của cả chuẩn và mẫu đều tốt. Ngoại trừ hai loại sialyllactose, LOD và LOQ ở mức µg/L. Phương pháp có độ đặc hiệu tốt, không tìm thấy tạp chất gây nhiễu và nhìn chung đáp ứng các yêu cầu tiêu chuẩn.