Xác định Aflatoxin B₁, chất gây ung thư nhóm 1, trong cây trồng chịu dầu bằng hệ thống LCMS-TQ9200 LC-MS/MS của Wayeal

Aflatoxin B₁là chất chuyển hóa thứ cấp có độc tính cao được sản xuất chủ yếu bởi Aspergillus flavusvà Aspergillus parasiticus. Trong số họ aflatoxin, nó có độc tính mạnh nhất và phân bố rộng nhất. Nó phát huy tác dụng độc hại bằng cách ức chế tổng hợp DNA và RNA nội bào và can thiệp vào quá trình chuyển hóa protein, với tác dụng gây tổn hại nghiêm trọng đến gan.So với các loại độc tố nấm mốc khác như ochratoxin và patulin, aflatoxin B₁cực kỳ độc hại và có khả năng gây ung thư đã được chứng minh rõ ràng. Nó đã được phân loại là một Chất gây ung thư nhóm 1của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Nó thường được phát hiện trong các loại cây trồng chứa dầu như đậu phộng, ngô, các loại hạt và dầu thực vật, khiến nó trở thành chất gây ô nhiễm ưu tiên để kiểm soát an toàn thực phẩm trên toàn thế giới.

Ô nhiễm aflatoxin B₁thường xảy ra khi cây trồng chứa dầu tiếp xúc với điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao trong quá trình trồng, thu hoạch hoặc bảo quản, điều này thúc đẩy sự phát triển của nấm. Hơn nữa, do tính chất hóa học ổn định nên aflatoxin B₁không thể bị phá hủy bởi nhiệt độ nấu thông thường, dẫn đến các vấn đề tồn dư thường xuyên trong nông sản và thực phẩm chế biến.

Uống liều cao trong thời gian ngắn có thể gây ngộ độc cấp tính, biểu hiện các triệu chứng như đau bụng dữ dội, nôn mửa, vàng da và suy gan, có thể gây tử vong trong trường hợp nặng. Phơi nhiễm liều thấp trong thời gian dài dẫn đến tích tụ trong gan, gây tổn thương gan mãn tính như xơ gan và xơ gan, thậm chí có thể gây ra ung thư gan nguyên phát. Những người có khả năng miễn dịch thấp hơn, bao gồm trẻ em, người già và những người mắc bệnh gan từ trước, có nguy cơ nhiễm aflatoxin B cao hơn.₁đầu độc.

Tại Trung Quốc, tiêu chuẩn quốc gia GB 2761-2017 (Tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc gia – Mức độ độc tố nấm mốc tối đa trong thực phẩm) quy định giới hạn dư lượng tối đa đối với aflatoxin B₁trong các loại thực phẩm khác nhau. Ngoài ra, GB 5009.22-2016 (Tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc gia – Xác định Aflatoxin B và G trong thực phẩm)cung cấp các phương pháp phân tích chính thức để xác định aflatoxin B₁.

Ghi chú áp dụng này mô tả việc thiết lập phương pháp sắc ký lỏng pha loãng đồng vị-khối phổ song song (LC-MS/MS) để xác định aflatoxin B₁sử dụng hệ thống LCMS-TQ9200 LC-MS/MS của Wayeal.

Từ khóa:Ba tứ cực; Aflatoxin B₁; Sắc ký lỏng pha loãng đồng vị-khối phổ song song.

1. Dụng cụ và thuốc thử

1.1 Cấu hình thiết bị

Bảng 1 Danh sách cấu hình thiết bị

1.2 Thuốc thử và chất chuẩn

Bảng 2 Thuốc thử và chất chuẩn

1.3 Vật liệu thí nghiệm và thiết bị phụ trợ

Máy trộn xoáy

Máy ly tâm tốc độ cao

Cân phân tích

Máy ly tâm

Đường ống chiết pha rắn (SPE) (có bơm chân không)

thiết bị bay hơi nitơ

máy lắc

2. Phương pháp thí nghiệm

2.1 Chuẩn bị dung dịch

2.1.1 Dung dịch amoni axetat 5 mmol/L:Cân 0,39g amoni axetat, hòa tan trong nước và pha loãng thành 1000mL. Trộn đều.

2.1.1 Dung dịch metanol-axetonitrile:Thêm 100mL axetonitril vào 100mL metanol, sau đó trộn đều.

2.2 Tiền xử lý mẫu

2.2.1 Chiết mẫu

Cho bột mì qua rây thử có khẩu độ 2 mm. Cân 5g mẫu (chính xác đến 0,01g) cho vào ống ly tâm 50mL. Thêm 100μL dung dịch làm việc chuẩn nội đồng vị (100ng/mL), trộn bằng cách vortex và để yên trong 30 phút. Thêm 20mL dung dịch metanol-nước (70+30, v/v), vortex để trộn và lắc trên máy lắc quỹ đạo trong 20 phút. Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút. Thu lấy phần nổi phía trên để sử dụng tiếp theo.

2.2.2 Tinh sạch mẫu

Chuyển chính xác 4 mL chất nổi phía trên vào bình chứa, thêm 23 mL Triton X-100 1% trong PBS và trộn đều.

Sau khi chất lỏng ban đầu trong cột ái lực miễn dịch đã cạn hết, chuyển dung dịch mẫu trên vào ống tiêm 50 mL. Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho dung dịch mẫu đi qua cột đều đặn với tốc độ 1–3 mL/phút. Sau khi dung dịch mẫu đã cạn hết, thêm 2 × 10 mL nước vào ống tiêm và rửa cột ái lực miễn dịch ở tốc độ dòng chảy ổn định. Sau khi xả hết nước, làm khô cột bằng bơm chân không.

Ngắt kết nối hệ thống chân không. Đặt ống nghiệm chia độ 10 mL dưới cột ái lực miễn dịch, tháo ống tiêm 50 mL và thêm 2 × 1 mL metanol để rửa giải cột với tốc độ dòng được kiểm soát là 1–3 mL/phút. Sau đó làm khô cột lại bằng bơm chân không. Thu toàn bộ dịch rửa giải vào ống nghiệm.Làm bay hơi nhẹ dịch rửa giải đến gần khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50°C. Thêm 1 mL pha động ban đầu, lắc đều trong 30 giây để hòa tan cặn. Lọc qua màng lọc 0,22 μm và thu dịch lọc vào lọ lấy mẫu tự động để bơm tiếp theo.

2.3 Điều kiện thí nghiệm

2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng

Cột: C18, 1.7μm, 2.1×50mm

Pha động: A: Dung dịch metanol-acetonitril; Pha B: Dung dịch amoni axetat 5mmol/L

Tốc độ dòng chảy: 0,3 mL/phút

Nhiệt độ cột: 40°C

Thể tích tiêm: 3µL

2.3.2 Phương pháp khối phổ

Bảng 3 Các thông số của phép đo phổ khối hợp chất

Lưu ý: Dấu hoa thị (*) biểu thị ion định lượng.

3. Kết quả thí nghiệm

3.1 Sắc ký đồ chuẩn

Xác định aflatoxin B₁và chất chuẩn nội đồng vị 13C17-aflatoxin B₁đã được hoàn thành trong vòng 5 phút. Như được minh họa trong Hình 1, cả hai chất phân tích đều cho thấy hình dạng pic tuyệt vời và phản hồi thỏa đáng, đáp ứng các yêu cầu cho phân tích thử nghiệm.

Hình 1 Sắc ký đồ của Aflatoxin B₁và chất chuẩn nội đồng vị 13C17​-Aflatoxin B₁

3.2 Phạm vi tuyến tính

Một thể tích thích hợp của dung dịch chuẩn gốc và hỗn hợp dung dịch chuẩn nội chuẩn đồng vị được chuyển và pha loãng chính xác bằng pha động ban đầu để chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn làm việc có aflatoxin B.₁nồng độ 50, 20, 10, 5, 2, 1 và 0,5ng/mL. Mỗi dung dịch chứa chất chuẩn nội đồng vị ở nồng độ 2ng/mL. Một đường cong hiệu chuẩn được xây dựng bằng cách sử dụng các tiêu chuẩn này. Trong phạm vi tuyến tính 0,5–50ng/mL và sau khi hiệu chỉnh bằng 13C 17-aflatoxin B₁làm chất chuẩn nội, độ lệch giữa aflatoxin B đo được và aflatoxin danh nghĩa₁nồng độ nằm trong sai lệch tối đa cho phép. Hệ số tương quan (R) lớn hơn 0,999, cho thấy tính tuyến tính rất tốt.

Hình 2 Đường cong chuẩn của Aflatoxin B₁

3.3 Độ lặp lại

Dung dịch chuẩn ở ba nồng độ (1, 10 và 20 ng/mL) được tiêm sáu lần liên tiếp. Kết quả được thể hiện trong bảng dưới đây. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và lượng mẫu đối với aflatoxin B₁ở nồng độ thấp, trung bình và cao đều nằm trong khoảng 5%, đáp ứng yêu cầu của thí nghiệm.

Bảng 4 Thử nghiệm độ lặp lại đối với Aflatoxin B₁ở nồng độ thấp, trung bình và cao

3.4 Phục hồi đột biến

Aflatoxin B₁dung dịch chuẩn được thêm vào mẫu để đạt được nồng độ cuối cùng là 5ng/mL. Sau đó, mẫu thêm chuẩn được phân tích bằng LC-MS/MS. Kết quả trung bình từ sáu lần tiêm liên tiếp là 5,147ng/mL, với RSD là 1,954%. Tỷ lệ thu hồi tính toán được là 102,94%, đáp ứng yêu cầu của thí nghiệm.

3.5 Phần dư trống

Sau khi tiêm liên tục dung dịch chuẩn 20 ng/mL, mẫu trắng sau đó được tiêm để đánh giá độ nhiễm chéo. Như được hiển thị trong Hình 3, không phát hiện thấy chất mang nào trong mẫu trắng.

Hình 3 Sắc ký đồ trắng của hợp chất

3.6 Thử nghiệm mẫu

Aflatoxin B₁không được phát hiện trong Mẫu A (Hình 4).

Hình 4 Sắc ký đồ của Aflatoxin B₁trong mẫu A

4. Kết luận

Trong nghiên cứu này, phương pháp sắc ký lỏng pha loãng đồng vị-khối phổ song song (LC-MS/MS) để xác định aflatoxin B₁được thành lập bằng hệ thống sắc ký lỏng song song khối phổ Wayeal LCMS-TQ9200. Dữ liệu thu được chứng minh rằng tất cả các pic sắc ký đều thể hiện hình dạng pic tốt mà không có đuôi. Độ nhạy đáp ứng yêu cầu thực nghiệm, hệ số tương quan (R) lớn hơn 0,999, thỏa mãn tiêu chí tuyến tính. Độ lặp lại ở nồng độ thấp, trung bình và cao nằm trong khoảng 5% và không quan sát thấy hiện tượng nhiễm chéo hệ thống sau khi bơm mẫu nồng độ cao. Những kết quả này chỉ ra rằng phương pháp này, khi được trang bị hệ thống sắc ký lỏng song song khối phổ Wayeal, sẽ đáp ứng các yêu cầu để phân tích định tính và định lượng thông thường các mẫu mục tiêu.