Xác định các dư lượng β-Agonist trong thịt lợn bằng cách sử dụng Wayeal LCMS-TQ9200 Hệ thống quang phổ khối lượng đồng thời nhiễm sắc thể lỏng

Thí nghiệm này tham khảo "Tiêu chuẩn An toàn Thực phẩm Quốc gia GB 31658.22-2022 — Xác định dư lượng β-Agonist trong thực phẩm có nguồn gốc động vật bằng sắc ký lỏng-khối phổ hai lần liên tiếp" và sử dụng hệ thống sắc ký lỏng-khối phổ hai lần liên tiếp Wayeal LCMS-TQ9200 để xác định hàm lượng β-agonist trong thịt lợn. Kết quả thí nghiệm cho thấy thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống cho thấy các đỉnh có hình dạng tốt và độ tuyến tính tốt, đáp ứng các yêu cầu thí nghiệm. Độ lặp lại thời gian lưu của dung dịch chuẩn làm việc β-agonist dưới 1% và độ lặp lại diện tích đỉnh dưới 3%, cho thấy độ lặp lại tốt. Đối với dung dịch thử nghiệm độ nhạy của β-agonist, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu của các đỉnh chính ở nồng độ 0,2ng/mL và 0,5ng/mL lần lượt lớn hơn đáng kể so với 3 và 10, đáp ứng các yêu cầu thí nghiệm.

Không phát hiện thấy β-agonist trong thử nghiệm mẫu thịt lợn. Tất cả các dữ liệu trên đều đáp ứng các yêu cầu về thiết bị theo phương pháp tiêu chuẩn.

Từ khóa:Sắc ký lỏng-khối phổ hai lần liên tiếp; β-Agonist; Clenbuterol; An toàn thực phẩm.

1. Dụng cụ và Thuốc thử

1.1 Danh sách cấu hình LCMS

Bảng 1 Danh sách cấu hình dụng cụ

1.2 Thuốc thử và Chất chuẩn

Bảng 2 Danh sách thuốc thử và chất chuẩn

1.3 Vật liệu thí nghiệm và Thiết bị phụ trợ

Máy làm sạch bằng sóng siêu âm

Máy trộn Vortex

Máy lắc ổn định nhiệt độ cách thủy

Máy ly tâm tốc độ cao

2. Phương pháp thí nghiệm

2.1 Xử lý trước mẫu

2.1.1 Thủy phân enzyme và chiết xuất

Cân 2g mẫu (chính xác đến ±0,05g) vào ống ly tâm 50mL. Thêm 6mL dung dịch đệm amoni axetat 0,2mol/L và 40μL β-glucuronidase/arylsulfatase. Dùng vortex trộn đều và ủ ở 37°C trong bóng tối với lắc trong bể cách thủy trong 16 giờ. Để nguội về nhiệt độ phòng để sử dụng sau.

2.1.2 Chiết xuất, tinh sạch và cô đặc

Lấy dung dịch đã chuẩn bị, thêm 100μL dung dịch chuẩn nội 100ng/mL, dùng vortex trộn đều và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 8 phút. Thu dịch nổi, thêm 5mL dung dịch axit percloric 0,1mol/L, dùng vortex trộn đều và điều chỉnh pH về 1,0 ± 0,2 bằng axit percloric. Sau khi ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 8 phút, điều chỉnh pH của dịch nổi về 10 ± 0,5 bằng dung dịch natri hydroxit 10mol/L. Thêm 15mL ethyl axetat, lắc ở tốc độ trung bình trong 5 phút và ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút. Thu lớp hữu cơ phía trên. Đối với lớp nước còn lại, thêm 10mL tert-butyl methyl ether, lắc ở tốc độ trung bình trong 5 phút, ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút và thu lớp hữu cơ phía trên. Kết hợp tất cả các lớp hữu cơ và làm bay hơi đến khô dưới luồng nitơ ở 50°C. Hòa tan cặn trong 5mL dung dịch axit formic 2% và để riêng. Chuẩn bị cột chiết pha rắn trao đổi cation hỗn hợp bằng cách kích hoạt tuần tự bằng 3mL methanol và 3mL axit formic 2%. Nạp dung dịch đã chuẩn bị lên cột, rửa tuần tự bằng 3mL axit formic 2% và 3mL methanol, và làm khô dưới chân không. Giải hấp cột bằng 3mL dung dịch methanol amoniac 5%. Làm bay hơi dịch chiết đến khô dưới luồng nitơ ở 50°C. Hòa tan lại cặn trong 0,5mL dung dịch methanol–axit formic 0,1% (10:90, v/v), trộn đều và lọc qua màng microporous 0,22μm để phân tích bằng sắc ký lỏng-khối phổ hai lần liên tiếp.

2.2 Điều kiện thí nghiệm

2.2.1 Điều kiện sắc ký lỏng

Cột sắc ký” C18, 1,8μm 2,1*100mm

Pha động: A: 0,1% Axit Formic trong Nước; B: Methanol

Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút

Nhiệt độ cột: 40°C

Thể tích tiêm: 3μL

3. Thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống

Thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống cho thấy các đỉnh mục tiêu có hình dạng tốt, không bị nhiễu từ các đỉnh tạp chất khác, đáp ứng các yêu cầu thí nghiệm.

Hình 1 Sắc ký đồ của Bảy β-Agonist (1ng/mL)

3.2 Khoảng tuyến tính

Lấy dung dịch chuẩn β-agonist và sử dụng dung dịch làm việc nồng độ trung gian, một đường chuẩn đã được chuẩn bị theo từng bước. Khoảng tuyến tính cho bảy β-agonist là 0,5–50ng/mL, với R² > 0,99, cho thấy mối quan hệ tuyến tính tốt.

Bảng 3 Bảng khoảng tuyến tính cho β-Agonist

Hình 2 Sắc ký đồ đường chuẩn của Bảy β-Agonist

3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)

Trong phương pháp này, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cho β-agonist được đặt lần lượt là 0,2ng/mL và 0,5ng/mL. Đối với mỗi hợp chất trong phương pháp này, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu ở các nồng độ quy định cho LOD và LOQ lớn hơn lần lượt là 3 và 10, đáp ứng các yêu cầu về độ nhạy của thí nghiệm.

Bảng 4 Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu tương ứng cho LOD và LOQ của mỗi hợp chất

Hình 3 Sắc ký đồ ion của Bảy β-Agonist ở nồng độ LOD và LOQ

3.4 Thử nghiệm độ chính xác

Một dung dịch hỗn hợp các chất chuẩn β-agonist ở nồng độ thấp, trung bình và cao đã được lấy và tiêm liên tiếp sáu lần để so sánh độ lệch thời gian lưu và diện tích đỉnh. Kết quả được hiển thị trong bảng dưới đây. Tất cả các β-agonist đều cho thấy độ lệch thời gian lưu dưới 1% và độ lệch diện tích đỉnh dưới 3%, đáp ứng các yêu cầu thí nghiệm.

Bảng 5 Thử nghiệm độ chính xác cho mỗi hợp chất

Hình 4 Sắc ký đồ thử nghiệm độ chính xác của Bảy β-Agonist (6 lần tiêm)

3.5 Thử nghiệm mẫu

Các mẫu thịt lợn mua từ thị trường đã được thử nghiệm theo phương pháp xử lý trước đã đề cập và không phát hiện thấy β-agonist. Không quan sát thấy các đỉnh sắc ký ở thời gian lưu tương ứng với bảy β-agonist, trong khi các đỉnh khác đại diện cho các tín hiệu ma trận sau khi thủy phân enzyme.

Hình 5 Sắc ký đồ thử nghiệm mẫu thịt lợn

4. Kết luận

Phương pháp này sử dụng hệ thống sắc ký lỏng-khối phổ hai lần liên tiếp Wayeal LCMS-TQ9200 để xác định β-agonist trong thịt lợn. Dữ liệu cho thấy tất cả các đỉnh sắc ký đều thể hiện hình dạng tốt, không có đuôi, độ nhạy đáp ứng các yêu cầu thí nghiệm, hệ số tương quan tuyến tính vượt quá 0,99 và độ chính xác đạt yêu cầu với độ lệch thời gian lưu dưới 1% và độ lệch diện tích đỉnh trong vòng 3% đối với sáu lần tiêm liên tiếp của mỗi hợp chất. Không phát hiện thấy β-agonist trong các thử nghiệm mẫu thịt lợn. Những kết quả này cho thấy phương pháp, được trang bị hệ thống Wayeal LC-MS/MS, đáp ứng các yêu cầu phát hiện định tính và định lượng thông thường đối với các chất phân tích mục tiêu.