Xác định dư lượng kháng sinh Amphenicol trong thịt gà bằng LCMS-TQ9200 Wayeal

Từ khóa:LCMS, amphenicol, an toàn thực phẩm, dư lượng thuốc thú y.

1. Công cụ và chất phản ứng

1.1 Danh sách cấu hình của LCMS

Bảng 1 Danh sách cấu hình thiết bị

1.3 Vật liệu thí nghiệm và thiết bị phụ trợ

Máy làm sạch siêu âm

Máy trộn xoáy

Máy bốc hơi nitơ tắm nước

Máy ly tâm tốc độ cao

2Phương pháp thí nghiệm

2.1 Chuẩn bị dung dịch

2.1.1 2% dung dịch axet ethyl amoniac: lấy 4mL nước amoniac và pha loãng đến 200mL với axet ethyl.

2.1.2 4% dung dịch natri clorua: lấy 4g natri clorua, hòa tan trong nước và pha loãng đến 100mL.

2.1.3 dung dịch n-Hexan bão hòa 4% natri clorua: lấy một lượng thích hợp dung dịch natri clorua 4%, thêm một lượng n-Hexan dư thừa, trộn, để đứng để tách lớp,và lấy lớp n-hexane trên cùng.

2.1.4 Giải pháp làm việc chuẩn nội bộ hỗn hợp: Lấy một lượng thích hợp của giải pháp hỗn hợp chuẩn nội bộ,loãng với 20% methanol để đạt được chloramphenicol-D5 ở 10ng/mL và các tiêu chuẩn nội bộ khác (florfenicol-D3, thiamphenicol-D3 và florfenicol amine-D3) ở mỗi 50ng/ml.

2.2 Xử lý trước mẫu

2.2.1 Lấy mẫu: Đánh nặng 2g mẫu (chỉ với độ chính xác ±0,01g), thêm 100μL dung dịch làm việc tiêu chuẩn hỗn hợp bên trong, xoáy trong 1 phút, thêm 10mL dung dịch axet ethyl ammoniate 2%,xoáy trong 10 phút, ly tâm ở 8000rpm trong 5 phút, và thu thập chất siêu sinh. Thêm thêm 10mL dung dịch 2% ammoniate ethyl acetate vào dư lượng, và lặp lại quy trình chiết xuất.Kết hợp hai supernatants, bốc hơi đến khô dưới dòng nitơ ở 50 °C, và lưu trữ để sử dụng.

2.2.2 Làm sạch mẫu: Thêm 3mL dung dịch natri clorua 4% vào dư lượng làm sạch, xoáy để hòa tan, sau đó thêm 5mL dung dịch n-hexan bão hòa natri clorua 4%, xoáy trong 30 giây.ly tâm ở 8000 rpm trong 5 phút, và loại bỏ lớp n-hexane phía trên. Lặp lại quy trình khử mỡ một lần. Thêm 5mL dung dịch 2% axet ethyl ammoniated, xoáy trong 10 phút, ly tâm ở 8000 rpm trong 5 phút,và thu thập các supernatantThêm thêm 5 ml dung dịch 2% ammoniated ethyl acetate vào dư lượng và lặp lại quy trình chiết xuất.thêm 1mL dung dịch methanol 20%, xoáy trong 30s, lọc qua màng, và chờ phân tích thiết bị.

2.3 Điều kiện thử nghiệm

2.3.1 Điều kiện Chromatography Lỏng

Cột Chromatography: C18 1,7μm 2.1x50mm

Giai đoạn di động: A: Acetonitrile; B: 2 mM Ammonium Formate trong nước

Tốc độ lưu lượng: 0,3mL/min

Nhiệt độ cột: 40 °C

Khối lượng tiêm: 5μL

2.3.2 Điều kiện quang phổ khối lượng

Bảng 3 Các thông số nguồn ion

3Kết quả thí nghiệm.

3.1 Chromatogram tiêu chuẩn

Việc xác định bốn loại kháng sinh amide và tiêu chuẩn nội bộ của chúng đã được hoàn thành trong vòng 6 phút.và mỗi hợp chất cho thấy phản ứng thỏa đáng, đáp ứng các yêu cầu thử nghiệm.

Hình 1 Chromatogram của 4 kháng sinh Amphenicol và tiêu chuẩn nội bộ (Chloramphenicol 0.2ng/mL, Các kháng sinh khác 1ng/mL)

3.2 Phạm vi tuyến tính

Lấy một lượng thích hợp của dung dịch tiêu chuẩn hỗn hợp amide-alcohol và pha loãng nó dần dần đến một loạt các nồng độ để chuẩn bị đường cong tiêu chuẩn.Phương pháp tiêu chuẩn nội bộ đồng vị được sử dụng để phân tích định lượngPhạm vi tuyến tính là 0,2-10 ng/mL cho chloramphenicol và 1- 50 ng/mL cho florfenicol amine, thiamphenicol và florfenicol.Sự lệch giữa kết quả phát hiện tuyến tính và nồng độ được biết là nhỏ hơn so với độ lệch tối đa cho phép, với các giá trị R2 dao động từ 0,9958 đến 0.9998, cho thấy tính tuyến tính tuyệt vời cho tất cả các thành phần.

Bảng 4 Phạm vi tuyến tính của các hợp chất

Hình 2 Dữ liệu đường cong hiệu chuẩn của bốn hợp chất

3.3 LOD và LOQ

Tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc gia của Trung Quốc GB 31658.20-2022 quy định rằng đối với phương pháp này, giới hạn phát hiện (LOD) cho chloramphenicol là 0,1μg/kg và giới hạn định lượng (LOQ) là 0.2μg/kgTrong khi đó, đối với thiamphenicol, florfenicol và florfenicol amine, LOD là 0,5 μg/kg và LOQ là 1 μg/kg.Tỷ lệ tín hiệu-gọi với tiếng ồn cho tất cả các hợp chất mục tiêu ở nồng độ xác định của giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lớn hơn đáng kể 3 và 10, đáp ứng các yêu cầu độ nhạy được quy định trong tiêu chuẩn quốc gia.

Bảng 5 Giới hạn phát hiện và định lượng cho mỗi hợp chất

Hình 3 Chromatograms của giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho bốn hợp chất

3.4 Kiểm tra độ chính xác

Lấy nồng độ thấp, trung bình và cao các dung dịch hỗn hợp tiêu chuẩn amphenicol, và thực hiện sáu tiêm liên tiếp để so sánh các độ lệch trong thời gian giữ và vùng đỉnh.Kết quả được hiển thị trong bảng dưới đâyCác sai lệch thời gian giữ lại của tất cả các hợp chất amphenicol là ít hơn 1%, và các sai lệch khu vực đỉnh là ít hơn 5%,đáp ứng yêu cầu độ chính xác RSD ≤ 15% được chỉ định bởi tiêu chuẩn quốc gia.

Bảng 6 Kiểm tra độ chính xác cho mỗi hợp chất

Hình 4 Chromatogram chính xác của bốn hợp chất amide alcohol

3.5 Thử nghiệm khôi phục matrix spiking

Độ chính xác của phương pháp phát hiện này đã được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm phục hồi điểm.chuẩn bị các mẫu có ma trận ở nhiệt độ caoMỗi nồng độ nồng độ của các mẫu tăng đã được phân tích độc lập sáu lần.Tỷ lệ phục hồi được tính bằng cách so sánh nồng độ được phát hiện trong ma trận trước và sau khi tăngCác kết quả được hiển thị như sau: trong ma trận gà, tỷ lệ phục hồi của tất cả các hợp chất dao động từ 94,5% đến 107,2%, với CV trong 5%chỉ ra rằng độ chính xác đáp ứng các yêu cầu về phương pháp.

Bảng 6 Tỷ lệ phục hồi các hợp chất trong ma trận gà chín

3.6 Kiểm tra mẫu

Các mẫu ngực gà mua ngẫu nhiên từ siêu thị đã được chiết xuất và tinh khiết bằng phương pháp xử lý trước mẫu đã đề cập ở trên.Không có kháng sinh amide nào được phát hiện.

Hình 5 Chromatogram của bốn hợp chất Amide Alcohol trong mẫu ngực gà siêu thị

4Kết luận

Phương pháp này sử dụng hệ thống quang phổ khối lượng nhiễm sắc thể lỏng Wayeal LCMS-TQ9200 để xác định kháng sinh amphenicol trong thực phẩm có nguồn gốc động vật,cho phép thu thập đồng thời các hợp chất trong cả chế độ ion dương và âmDữ liệu chỉ ra rằng phương pháp cung cấp các đỉnh sắc thái có hình dạng tốt mà không có đuôi, và độ nhạy của nó đáp ứng các yêu cầu tiêu chuẩn quốc gia.Các hệ số tương quan tuyến tính đều lớn hơn 0.99Sự lệch thời gian giữ lại cho tất cả các hợp chất trong sáu lần tiêm liên tiếp là trong 1% và sự lệch khu vực đỉnh là trong 5%, cho thấy độ chính xác tốt.Tỷ lệ phục hồi tăng trong ma trận gà dao động từ 940,5% đến 107,2%, với CV trong phạm vi 5%, cho thấy độ chính xác đáp ứng các yêu cầu về phương pháp.và không có kháng sinh amphenicol nào được phát hiệnĐiều này chứng minh rằng phương pháp, được trang bị hệ thống quang phổ khối lượng nhiễm sắc thể lỏng Wayeal,đáp ứng các yêu cầu về phát hiện định lượng và định chất thường xuyên của các mẫu mục tiêu.