Xác định dư lượng Erythromycin trong cặn lên men kháng sinh bằng hệ thống sắc ký lỏng - khối phổ LCMS-TQ9200 Wayeal

Erythromycin là một kháng sinh macrolide được sản xuất bằng cách lên men Streptomyces erythreus. Nó phát huy tác dụng kháng khuẩn chủ yếu bằng cách ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Việc sản xuất erythromycin chủ yếu dựa vào công nghệ lên men sinh học, bao gồm các bước như chọn lọc chủng, nuôi cấy giống, lên men quy mô lớn trong bể, chiết xuất và tinh chế. Sau khi lên men, erythromycin được chiết xuất bằng dung môi hữu cơ (chẳng hạn như butyl acetate), sau đó tinh chế bằng cách kết tinh hoặc tách bằng nhựa trao đổi ion, cuối cùng tạo ra các muối cấp độ lâm sàng (ví dụ: erythromycin ethylsuccinate). Tuy nhiên, quá trình sản xuất erythromycin tạo ra một lượng lớn bã nấm (cặn lên men), có thể chứa kháng sinh còn sót lại, protein vi sinh vật và các sản phẩm phụ trao đổi chất. Nếu không được quản lý đúng cách, những cặn này có thể xâm nhập vào chuỗi sinh thái thông qua việc thải ra môi trường hoặc sử dụng làm chất phụ gia thức ăn chăn nuôi, dẫn đến nhiều mối nguy hiểm: Erythromycin còn sót lại có thể thúc đẩy sự lây lan của gen kháng kháng sinh trong đất và nguồn nước, phá vỡ sự cân bằng của quần thể vi sinh vật; khuếch đại thông qua chuỗi thức ăn, nó có thể gây ra sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng thuốc ở động vật hoặc con người, làm suy yếu hiệu quả của kháng sinh; hơn nữa, chất hữu cơ chưa được sử dụng hết trong cặn có thể gây ô nhiễm môi trường. Do đó, việc kiểm soát nghiêm ngặt cặn nấm là một biện pháp quan trọng để kiểm soát ô nhiễm từ việc sản xuất erythromycin.

Thí nghiệm này được tiến hành tham khảo tiêu chuẩn "T/PIAC 00003—2021 Tiêu chuẩn nhóm của Hiệp hội Công nghiệp Dược phẩm Trung Quốc - Phương pháp xác định erythromycin trong cặn kháng sinh, vật liệu nền phân bón hữu cơ, cây trồng và môi trường", sử dụng hệ thống sắc ký lỏng-phổ khối LCMS-TQ9200 Wayeal để xác định hàm lượng erythromycin trong bã nấm. Kết quả thí nghiệm cho thấy thử nghiệm phù hợp của hệ thống cho thấy hình dạng đỉnh tốt và độ tuyến tính tốt, đáp ứng các yêu cầu thí nghiệm.

1. Dụng cụ và Thuốc thử

1.1 Danh sách cấu hình LCMS

Bảng 1 Danh sách cấu hình dụng cụ

1.2 Thuốc thử và Tiêu chuẩn

Bảng 2 Danh sách Thuốc thử và Tiêu chuẩn

1.3 Vật liệu thí nghiệm và Thiết bị phụ trợ

Máy làm sạch bằng sóng siêu âm

Máy trộn Vortex

Máy ly tâm tốc độ cao

2. Phương pháp thí nghiệm

2.1 Xử lý trước mẫu

Cân 0.5g mẫu (chính xác đến 0.001 g) vào ống nghiệm có nút thủy tinh. Thêm 50mL acetonitrile, trộn vortex trong 1 phút để đồng nhất hỗn hợp và thực hiện chiết xuất bằng sóng siêu âm trong 20 phút. Sau đó chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm 50mL và ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút. Thu thập một lượng thích hợp dịch nổi và cho qua màng lọc 0.22μm. Loại bỏ ít nhất 1mL dịch lọc ban đầu, sau đó chuyển phần dịch lọc còn lại vào lọ LC màu hổ phách để phân tích.

2.2 Điều kiện thí nghiệm

2.2.1 Điều kiện phương pháp sắc ký lỏng

Cột sắc ký: C18 1.7μm 2.1x50mm

Pha động: A: Acetonitrile, B: 0.1% Axit formic trong nước

Tốc độ dòng: 0.3mL/phút

Nhiệt độ cột: 30℃

Thể tích tiêm: 2μL

2.2.2 Điều kiện phương pháp phổ khối

Bảng 3 Thông số nguồn ion phổ khối

3. Kết quả thí nghiệm

3.1 Thử nghiệm phù hợp của hệ thống

Kết quả thử nghiệm phù hợp của hệ thống cho thấy các đỉnh mục tiêu được xác định rõ ràng mà không bị nhiễu từ các đỉnh bên ngoài, đáp ứng tất cả các yêu cầu thí nghiệm.

Hình 1 Sắc ký đồ của Dung dịch chuẩn Erythromycin A (0.5ng/mL)

3.2 Khoảng tuyến tính

Đường chuẩn cho erythromycin A được chuẩn bị bằng cách pha loãng liên tiếp dung dịch chuẩn bằng dung dịch làm việc nồng độ trung gian. Đường cong cho thấy độ tuyến tính tuyệt vời trong khoảng 0.5-500ng/mL, với hệ số tương quan (R²) lớn hơn 0.99.

Bảng 4 Khoảng tuyến tính của Erythromycin A

Hình 2 Đường chuẩn cho Erythromycin A

3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)

Trong phương pháp này, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đối với dung dịch chuẩn erythromycin A được xác định lần lượt là 0.2ng/mL và 0.5ng/mL. Tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm (S/N) tương ứng là 110.02 và 292.20, vượt xa các yêu cầu tối thiểu là 3 và 10, do đó đáp ứng các tiêu chí về độ nhạy của thí nghiệm.

Hình 3. Sắc ký đồ ion chiết xuất cho LOD và LOQ của Erythromycin A

3.4 Thử nghiệm độ chính xác

Dung dịch erythromycin A được tiêm liên tiếp bảy lần, kết quả được hiển thị trong hình dưới đây. Độ lệch thời gian lưu của erythromycin A là 0.19% và độ lệch diện tích đỉnh là 0.96%, cả hai đều dưới 5%, đáp ứng các yêu cầu thí nghiệm.

Hình 4. Sắc ký đồ độ chính xác của mẫu Erythromycin A (7 lần tiêm)

3.5 Thử nghiệm mẫu

Theo phương pháp xử lý trước đã đề cập, diện tích đỉnh mục tiêu trong mẫu rắn là 7.4E6. Tính toán theo phương pháp chuẩn ngoại, hàm lượng erythromycin A trong dung dịch mẫu được xác định là 400 ng/mL.

Hình 5 Sắc ký đồ của Thử nghiệm mẫu Erythromycin A

4. Kết luận

Phương pháp này sử dụng hệ thống sắc ký lỏng-phổ khối LCMS-TQ9200 Wayeal để xác định hàm lượng erythromycin A trong cặn lên men kháng sinh. Dữ liệu cho thấy phương pháp thể hiện hiệu suất tuyệt vời: tất cả các đỉnh sắc ký đều thể hiện hình dạng tối ưu mà không có đuôi và độ nhạy đáp ứng các yêu cầu thí nghiệm. Hệ số tương quan tuyến tính (R²) vượt quá 0.99. Độ lệch thời gian lưu và diện tích đỉnh đối với tất cả các hợp chất trong bảy lần tiêm liên tiếp đều nằm trong 1%, cho thấy độ chính xác cao. Sắc ký đồ mẫu không cho thấy sự nhiễu từ các đỉnh bên ngoài và hàm lượng mẫu đo được là 400ng/mL. Phương pháp này được trang bị hệ thống Wayeal LC-MS/MS, đáp ứng các yêu cầu phân tích định tính và định lượng thông thường của các mẫu thử nghiệm.