Xác định Methionine Hydroxy Analogue trong thức ăn bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao của Wayeal

Analogue Hydroxy Methionine (MHA) là một chất phụ gia axit hữu cơ được sử dụng rộng rãi trong ngành thức ăn chăn nuôi như một chất thay thế cho methionine. MHA được sử dụng rộng rãi trong thức ăn gia cầm (gà thịt và gà đẻ), lợn (lợn con và lợn thịt), gia súc nhai lại (bò sữa và bò thịt) và nuôi trồng thủy sản (cá và tôm). Là chất thay thế cho methionine, nó thể hiện hiệu quả đáng kể trong việc giảm chi phí thức ăn, cải thiện môi trường đường ruột của động vật và tăng cường khả năng miễn dịch của động vật.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phát hiện UV rất phù hợp để phân tích nhiều mẫu thức ăn phức tạp, nhờ hiệu quả tách tuyệt vời, khả năng chống nhiễu nền mạnh, độ nhạy phát hiện cao và kết quả định lượng ổn định và đáng tin cậy. Thí nghiệm này được thực hiện theo tiêu chuẩn "Xác định Analogue Hydroxy Methionine trong Thức ăn bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao" (GB/T 19371-2025). Một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao dòng Wayeal LC3400 được trang bị đầu dò UV đã được sử dụng để xác nhận quy trình tiền xử lý mẫu và hệ thống tách và phát hiện sắc ký lỏng, cho phép cả phát hiện định tính và phân tích định lượng chính xác analogue hydroxy methionine trong các loại mẫu thức ăn khác nhau.

Từ khóa: thức ăn chăn nuôi; analogue hydroxy methionine; sắc ký lỏng hiệu năng cao.

1. Thiết bị và Hóa chất

1.1 Danh sách cấu hình HPLC

Bảng 1 Danh sách cấu hình hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2 Danh sách hóa chất và tiêu chuẩn tham chiếu

Bảng 2 Danh sách hóa chất và tiêu chuẩn tham chiếu

1.3 Điều kiện sắc ký lỏng

Bảng 3 Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4 Vật liệu thí nghiệm và thiết bị phụ trợ

Máy làm sạch bằng siêu âm;

Máy trộn Vortex;

Máy ly tâm tốc độ cao;

Cân phân tích;

Máy lắc.

2. Phương pháp thí nghiệm

2.1 Chuẩn bị dung dịch

2.1.1 Dung dịch đường chuẩn:

Cân chính xác một lượng thích hợp tiêu chuẩn tham chiếu Analogue Hydroxy Methionine và hòa tan trong 10% acetonitrile để chuẩn bị một loạt dung dịch chuẩn với nồng độ khối lượng là 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 40.0 và 80.0μg/mL. Chuyển chính xác 5mL mỗi dung dịch chuẩn vào các ống nghiệm có nút đậy 15mL riêng biệt. Thêm chính xác 0.1mL dung dịch kali hydroxit 50% và trộn vortex trong 15 giây. Sau đó, thêm chính xác 0.2mL dung dịch axit photphoric 50% và trộn vortex thêm 15 giây. Ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 5 phút. Lọc dịch nổi qua màng lọc vi xốp trước khi phân tích.

2.1.2 Dung dịch mẫu thử:

Cân 5g mẫu thức ăn vào một bình chứa, thêm 50mL dung dịch acetonitrile 10% và trộn trong 30 giây. Đặt lên máy lắc và lắc trong 30 phút. Ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 5 phút và giữ lại dịch nổi để sử dụng sau. Chuyển chính xác 5mL dịch nổi trên vào một ống nghiệm có nút đậy 15mL. Thêm chính xác 0.1mL dung dịch kali hydroxit 50% và trộn vortex trong 15 giây. Sau đó, thêm chính xác 0.2mL dung dịch axit photphoric 50% và trộn vortex thêm 15 giây. Ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 5 phút. Lọc dịch nổi qua màng lọc vi xốp trước khi phân tích. Chuẩn bị hai dung dịch mẫu thử song song.

2.1.3 Dung dịch kiểm tra thu hồi:

Chuyển chính xác 2.5mL dịch nổi mẫu và 2.5mL mỗi dung dịch chuẩn dãy vào một ống nghiệm có nút đậy 15mL. Thêm chính xác 0.1mL dung dịch kali hydroxit 50% và trộn vortex trong 15 giây. Sau đó, thêm chính xác 0.2mL dung dịch axit photphoric 50% và trộn vortex thêm 15 giây. Ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 5 phút. Lọc dịch nổi qua màng lọc vi xốp trước khi phân tích.

3. Kết quả thí nghiệm

3.1 Tuyến tính và phạm vi

Bảng 4 Bảng nồng độ đường chuẩn

Hình 1 Đường chuẩn của Analogue Hydroxy Methionine

Lưu ý: Lấy một lượng thích hợp dung dịch tiêu chuẩn tham chiếu Analogue Hydroxy Methionine và pha loãng liên tiếp thành một loạt nồng độ để chuẩn bị đường chuẩn. Phạm vi tuyến tính là 0.5–80.0 μg/mL, và hệ số tương quan (R) là 0.99983, cho thấy tính tuyến tính tuyệt vời của chất phân tích.

3.2 Độ chính xác

Hình 2 Sắc ký chồng của kiểm tra độ chính xác cho tiêu chuẩn tham chiếu (20.0μg/mL)

Bảng 5 Dữ liệu kiểm tra độ chính xác cho tiêu chuẩn tham chiếu (20.0μg/mL)

Lưu ý: Tiêu chuẩn tham chiếu của Analogue Hydroxy Methionine (ở nồng độ 20.0μg/mL) được tiêm liên tục 6 lần lặp lại. Độ lặp lại (RSD) của thời gian lưu là 0.084% và diện tích đỉnh là 0.391%, cho thấy độ chính xác của thiết bị tốt.

3.3 Thu hồi

Hình 3 Sắc ký chồng của kiểm tra thu hồi Analogue Hydroxy Methionine trong thức ăn

Bảng 6 Dữ liệu kiểm tra thu hồi Analogue Hydroxy Methionine trong thức ăn

Lưu ý: Mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 40.0μg/mL và phân tích theo quy trình trên. Tỷ lệ thu hồi thu được là 88.56%, cho thấy độ chính xác tốt của phương pháp.

3.4 Giới hạn phát hiện (LOD)

Hình 4 Sắc ký của tiêu chuẩn Analogue Hydroxy Methionine (2.5μg/mL)

Bảng 7 Dữ liệu kiểm tra cho tiêu chuẩn tham chiếu Analogue Hydroxy Methionine (2.5μg/mL)

Lưu ý: Dựa trên dữ liệu kiểm tra của tiêu chuẩn tham chiếu Analogue Hydroxy Methionine ở nồng độ 2.5μg/mL như trong bảng trên, giới hạn phát hiện lý thuyết (LOD) được tính là 0.033μg/mL ở tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu là 3 (S/N = 3).

3.5 Kiểm tra mẫu thức ăn

Hình 5 Sắc ký của mẫu thức ăn

Lưu ý: Analogue Hydroxy Methionine đã được phát hiện trong mẫu thức ăn với nồng độ 0.402μg/mL.

4. Kết luận

Thí nghiệm này được thực hiện theo tiêu chuẩn "Xác định Analogue Hydroxy Methionine trong Thức ăn bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao" (GB/T 19371-2025), sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao dòng Wayeal LC3400 được trang bị đầu dò UV. Kết quả thí nghiệm cho thấy đỉnh mục tiêu có độ đối xứng tốt và số đĩa lý thuyết cao. Trong phạm vi nồng độ từ 0.5–80.0μg/mL, hệ số tương quan (R) trên 0.9998. Giá trị RSD cho thời gian lưu và diện tích đỉnh của tiêu chuẩn tham chiếu MHA (20.0μg/mL) lần lượt là 0.084% và 0.391%, cho thấy độ chính xác của thiết bị tuyệt vời. Tỷ lệ thu hồi MHA trong mẫu thức ăn được thêm chuẩn ở nồng độ 40.0μg/mL là 88.56%, cho thấy độ chính xác tốt của phương pháp. Giới hạn phát hiện lý thuyết (LOD) của MHA được xác định là 0.033μg/mL. MHA đã được phát hiện thành công trong mẫu thức ăn với nồng độ 0.402μg/mL. Tất cả dữ liệu trên đều đáp ứng yêu cầu về hiệu suất thiết bị của phương pháp dược điển.