Xác định Rhodamine B trong bột ớt bằng Hệ thống LCMS/MS WAYEAL LCMS-TQ9200

Rhodamine B (còn được gọi là Rose Red B hoặc Basic Violet 10) là một loại thuốc nhuộm huỳnh quang cơ bản tổng hợp thuộc nhóm hóa chất xanthene. Bản thân chất này có màu đỏ hồng rực rỡ và dễ dàng hòa tan trong các dung môi phân cực như nước và ethanol. Ban đầu, nó được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghiệp bao gồm dệt may, in ấn và dán nhãn huỳnh quang. Do chi phí thấp và khả năng tạo màu mạnh, một số thương nhân vô lương tâm đã bất hợp pháp thêm nó vào các sản phẩm thực phẩm để tạo màu, chẳng hạn như bột ớt, hạt tiêu Tứ Xuyên, các sản phẩm thịt và gia vị, khiến nó trở thành một chất ô nhiễm quan trọng gây nguy hiểm cho an toàn thực phẩm.
Rhodamine B rõ ràng là độc hại đối với cơ thể con người. Nó có thể xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa hoặc da, gây cản trở quá trình trao đổi chất sinh lý bình thường. Ngoài ra, nó còn tiềm ẩn nguy cơ gây ung thư và đột biến gen. Do đó, nó đã được nhiều quốc gia phân loại là chất không ăn được, bị cấm sử dụng trong thực phẩm. Nó là mục tiêu chính của giám sát an toàn thực phẩm và tỷ lệ phát hiện nó vẫn luôn cao trong các loại gia vị và thực phẩm chế biến khác nhau.

Trong ghi chú ứng dụng này, một phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ song song (LC-MS/MS) để xác định Rhodamine B trong thực phẩm đã được thiết lập bằng hệ thống sắc ký lỏng-khối phổ song song WAYEAL LCMS-TQ9200. Phương pháp này đạt được hiệu quả chiết xuất, tách chính xác và định lượng nhạy của chất phân tích mục tiêu, đồng thời loại bỏ hiệu quả sự can thiệp của ma trận thực phẩm. Nó cung cấp hỗ trợ kỹ thuật đáng tin cậy cho việc sàng lọc nhanh chóng và định lượng chính xác Rhodamine B trong thực phẩm, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc giám sát an toàn thực phẩm hiệu quả.

Từ khóa: An toàn thực phẩm, Rhodamine B, LCMS/MS

1. Thiết bị và Hóa chất

1.1 Cấu hình thiết bị

Bảng 1 Danh sách cấu hình thiết bị

1.2 Danh sách hóa chất và tiêu chuẩn

Bảng 2 Danh sách hóa chất và tiêu chuẩn

1.3 Vật liệu thí nghiệm và thiết bị phụ trợ

Máy trộn Vortex

Máy ly tâm tốc độ cao

Cân phân tích

Hệ thống chiết pha rắn (SPE) (có bơm chân không)

Máy bay hơi nitơ

Máy lắc quỹ đạo

2. Phương pháp thí nghiệm

2.1 Chuẩn bị dung dịch

2.1.1 Axit formic 0,1% trong nước: Chuyển 1mL axit formic vào 500mL nước, trộn đều và điều chỉnh thể tích cuối cùng lên 1000 mL bằng nước.

2.1.2 Axit formic 0,1% trong Acetonitrile: Chuyển 1mL axit formic vào 500mL acetonitrile, trộn đều và điều chỉnh thể tích lên 1000mL bằng acetonitrile.

2.1.3 Methanol 50% trong nước: Chuyển chính xác 500mL methanol vào bình định mức 1L, sau đó điều chỉnh thể tích bằng nước.

2.1.4 Methanol 50% trong nước có axit formic 0,1%: Chuyển 1mL axit formic vào 500mL dung dịch methanol 50% trong nước, trộn đều và pha loãng đến thể tích 1000 mL bằng dung dịch methanol 50% trong nước.

2.1.5 Amoniac 5% trong Methanol: Chuyển 5mL dung dịch amoniac vào bình định mức 100mL, pha loãng đến thể tích bằng methanol và trộn đều.

2.2 Tiền xử lý mẫu

2.2.1 Chiết mẫu

Cân chính xác 1g mẫu bột ớt cho vào ống ly tâm nhựa 50mL. Thêm chính xác 10,0mL dung dịch nước methanol 50% chứa 0,1% axit formic, và trộn đều. Thêm hai viên bi thủy tinh, sau đó vortex trong 15 phút trên máy vortex. Ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển 3mL dịch nổi (lớp chiết) và lọc qua màng lọc pha hữu cơ 0,45 μm trước khi tinh sạch.

2.2.2 Tinh sạch mẫu

Chuẩn bị cột chiết pha rắn (SPE) NovaPre MCX: Trước khi sử dụng, hoạt hóa tuần tự cột với 3mL methanol và 3mL nước.

Chuyển chính xác 1,0mL dịch chiết lên cột chiết pha rắn (SPE) NovaPre MCX. Rửa tuần tự cột với 3mL axit formic 0,1% trong nước, 3 mL nước và 3mL methanol. Elute chất phân tích mục tiêu bằng 6mL dung dịch amoniac trong methanol, và thu hồi dịch elute. Bay hơi dịch elute đến gần khô dưới dòng nitơ ở 45°C. Hòa tan cặn trong 0,5mL pha động ban đầu, lọc qua màng lọc pha hữu cơ 0,22 μm, sau đó tiêm dịch lọc để phân tích bằng thiết bị.

2.3 Điều kiện thí nghiệm

2.3.1 Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Cột sắc ký: C18, 1.7 μm, 2.1*50mm;
Pha động: Pha A: axit formic 0,1% trong nước; Pha B: axit formic 0,1% trong acetonitrile;
Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút;
Nhiệt độ cột: 40 °C;
Thể tích tiêm: 1 μL.

2.3.2 Điều kiện khối phổ

Bảng 3 Thông số khối phổ hợp chất

Lưu ý: * Ion định lượng.

3. Kết quả thí nghiệm

3.1 Sắc ký đồ tiêu chuẩn

Việc phát hiện Rhodamine B được hoàn thành trong vòng 7 phút. Như thể hiện trong Hình 1, đỉnh hợp chất cho thấy hình dạng đỉnh tốt và đáp ứng thỏa đáng, đáp ứng các yêu cầu cho việc xác định thực nghiệm.

Hình 1 Sắc ký đồ của Rhodamine B

3.2 Khoảng tuyến tính

Một lượng thích hợp dung dịch làm việc tiêu chuẩn Rhodamine B đã được chuyển chính xác và pha loãng bằng pha động ban đầu để chuẩn bị đường chuẩn. Khoảng tuyến tính là 0,1–10ng/mL. Độ lệch giữa kết quả tuyến tính và nồng độ đã biết nằm trong giới hạn sai số cho phép tối đa. Hệ số xác định (R²) lớn hơn 0,999, cho thấy tính tuyến tính tốt.

Hình 2 Đường chuẩn Rhodamine B

3.3 Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện

Trong phương pháp này, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đối với Rhodamine B đã được thiết lập lần lượt là 0,1 ng/mL và 0,5 ng/mL. Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) tương ứng được tóm tắt trong bảng dưới đây. Tỷ lệ S/N tại LOD vượt quá 3, trong khi tỷ lệ tại LOQ vượt quá 10.

Bảng 4 Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện

Hình 3 Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu tại LOD đối với Rhodamine B (0,1ng/mL)

Hình 4 Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu tại LOQ đối với Rhodamine B (0,5ng/mL)

3.4 Độ lặp lại

Các dung dịch tiêu chuẩn ở ba nồng độ (0,5, 2 và 5ng/mL) đã được tiêm sáu lần liên tiếp. Kết quả được thể hiện trong bảng dưới đây. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích đỉnh đối với Rhodamine B ở nồng độ thấp, trung bình và cao đều nằm trong khoảng 5%, đáp ứng yêu cầu thực nghiệm.

Bảng 5. Thử nghiệm độ lặp lại đối với Rhodamine B ở nồng độ thấp, trung bình và cao

Hình 5 Sắc ký đồ của 6 lần tiêm liên tiếp Rhodamine B 0,5ng/mL

Hình 6 Sắc ký đồ của 6 lần tiêm liên tiếp Rhodamine B 2ng/mL

Hình 7 Sắc ký đồ của 6 lần tiêm liên tiếp Rhodamine B 5ng/mL

3.5 Độ thu hồi khi thêm mẫu

Mẫu A được thêm dung dịch tiêu chuẩn để tăng nồng độ Rhodamine B lên 2ng/mL. Sau đó, sáu lần tiêm lặp lại đã được phân tích. Độ thu hồi thu được là 105,7% với RSD là 1,473%, đáp ứng các tiêu chí chấp nhận của phương pháp.

3.6 Hiện tượng mang theo

Sau khi tiêm dung dịch tiêu chuẩn 10ng/mL, dung môi trắng đã được tiêm để đánh giá hiện tượng mang theo. Kết quả được thể hiện trong hình dưới đây. Hiện tượng mang theo trong mẫu trắng nhỏ hơn 10% so với tiêu chuẩn hiệu chuẩn thấp nhất (0,1ng/mL), đáp ứng yêu cầu thực nghiệm.

Hình 8 Sắc ký đồ mẫu trắng của hợp chất

3.7 Thử nghiệm mẫu

Nồng độ Rhodamine B trong Mẫu A thấp hơn giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL).

Hình 9 Sắc ký đồ của Rhodamine B trong Mẫu A

4. Kết luận

Trong nghiên cứu này, một phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ song song (LC-MS/MS) để xác định Rhodamine B đã được thiết lập bằng hệ thống WAYEAL LCMS-TQ9200. Dữ liệu thu được cho thấy phương pháp tạo ra các đỉnh sắc ký có đối xứng tốt và không bị kéo đuôi, và độ nhạy đáp ứng yêu cầu thực nghiệm. Hệ số xác định (R²) lớn hơn 0,999, đáp ứng tiêu chí tuyến tính. Độ lặp lại (RSD) ở nồng độ thấp, trung bình và cao nằm trong khoảng 5%, và hiện tượng mang theo trong mẫu trắng nhỏ hơn 10% so với tiêu chuẩn hiệu chuẩn thấp nhất. Những kết quả này cho thấy phương pháp, khi kết hợp với hệ thống WAYEAL LC-MS/MS, có khả năng đáp ứng các yêu cầu phát hiện định tính và định lượng thông thường cho các chất phân tích mục tiêu.