2025-10-16
Máy dò tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) là một máy dò khối lượng mới lạ với khả năng ứng dụng lý thuyết cho bất kỳ hợp chất nào có thể tạo thành các hạt ở thể khí. Phiên bản năm 2025 của Dược điển quy định việc sử dụng Phát hiện tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) để phân tích và kiểm soát chất lượng của hơn 100 loại thuốc. Trong thực tế, ELSD thường được áp dụng hơn cho các hợp chất không có khả năng hấp thụ tia cực tím (UV), chẳng hạn như astragaloside, carbohydrate, aminoglycoside và cholesterol, thường đóng vai trò là một phương pháp phát hiện bổ sung cho các máy dò UV và huỳnh quang. Tuy nhiên, kết quả ELSD bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm thành phần pha động, nồng độ dung môi hữu cơ, chế độ rửa giải và điều kiện phun sương. Do đó, để đảm bảo kết quả phân tích chính xác và nhất quán, điều cần thiết là phải đánh giá tác động của các yếu tố này đến kết quả.
Nghiên cứu này, tham chiếu phương pháp phân tích spectinomycin hydrochloride từ Phần II của Dược điển năm 2025 và được hướng dẫn bởi các nguyên tắc ICH QbD, đã sử dụng thiết kế thí nghiệm trực giao để sàng lọc và tối ưu hóa các điều kiện phân tích.
Hình 1 Spectinomycin Hydrochloride
2. Dụng cụ và Phương pháp
Trong nghiên cứu này, phân tích sắc ký được thực hiện bằng hệ thống HPLC dòng LC3200 của Wayeal. Cấu hình thiết bị bao gồm bơm gradient bậc bốn, bộ lấy mẫu tự động, ngăn cột và Máy dò tán xạ ánh sáng bay hơi. Việc điều khiển hệ thống và thu thập/xử lý dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm sắc ký SmartLab 2.0.
Bảng 1 Điều kiện HPLC
| Cột sắc ký | Nova Atom PC18 (4.6*250mm, 5μm) |
| Pha động | Dung dịch nước axit trifluoroacetic 0.1mol/L |
| Tốc độ dòng (mL/phút) | 0.6 |
| Nhiệt độ cột | 35 |
| Thể tích tiêm (μL) | 20 |
| Nhiệt độ bộ phun sương ELSD （°C） | 85 |
| Nhiệt độ bay hơi ELSD （°C） | 80 |
| Nhiệt độ phát hiện ELSD (°C) | 50 |
| Tốc độ dòng khí （SLM） | 0.2 |
3. Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch mẫu:Dung dịch gốc spectinomycin hydrochloride được cung cấp bởi khách hàng với nồng độ ghi nhãn là 10 mg/mL và độ tinh khiết là 99.8%.
Dung dịch nước axit trifluoroacetic 0.1M：Hút chính xác 6.8mL axit trifluoroacetic vào bình định mức 1000mL. Pha loãng đến vạch bằng nước tinh khiết và trộn đều. Cuối cùng, lọc chân không dung dịch qua màng lọc cellulose 0.45μm trước khi sử dụng.
Dung dịch chuẩn:Dung dịch gốc được pha loãng bằng nước tinh khiết để chuẩn bị các dung dịch mẫu có nồng độ lần lượt là 0.15, 0.25, 0.35, 0.50 và 0.70mg/mL. Sau đó, mỗi dung dịch được lọc qua màng lọc cellulose 0.45μm trước khi sử dụng.
4. Kết quả và Thảo luận
Dược điển Trung Quốc sử dụng các điều kiện sắc ký giống hệt nhau để phân tích các chất liên quan và hàm lượng thành phần chính theo mục spectinomycin hydrochloride. Phương pháp này quy định rằng "máy dò có thể được cấu hình dựa trên các trường hợp thực tế." Trong quá trình nghiên cứu, xem xét các đặc điểm của thiết bị ELSD3260, các yêu cầu của phương pháp phân tích và tài liệu liên quan, một thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman đã được sử dụng để sàng lọc nhiều thông số thí nghiệm (Bảng 2 và 3). Sau đó, một thiết kế Box-Behnken (Bảng 4) đã được sử dụng để tối ưu hóa đáp ứng diện tích đỉnh của máy dò ELSD.
Bảng 2 Thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman
| Số | Tốc độ dòng (mL/phút) | Nhiệt độ cột (°C) | Nhiệt độ phun sương （°C） | Nhiệt độ bay hơi （°C） | Nhiệt độ phát hiện (°C) | Tốc độ dòng khí （SLM） | Bù sau cột |
| 1 | 0.8 | 35 | 60 | 50 | 50 | 0.4 | Không |
| 2 | 0.6 | 35 | 50 | 60 | 50 | 0.6 | Không |
| 3 | 0.6 | 30 | 60 | 60 | 50 | 0.4 | Có |
| 4 | 0.8 | 30 | 60 | 60 | 40 | 0.6 | Không |
| 5 | 0.6 | 35 | 60 | 50 | 40 | 0.6 | Có |
| 6 | 0.8 | 30 | 50 | 50 | 50 | 0.6 | Có |
| 7 | 0.8 | 35 | 50 | 60 | 40 | 0.4 | Có |
| 8 | 0.6 | 30 | 50 | 50 | 40 | 0.4 | Không |
Bảng 3 Phân tích ANOVA về kết quả thí nghiệm Plackett-Burman
| Nguồn biến thiên | Hệ số | Giá trị t | Giá trị p | Ý nghĩa |
| Tốc độ dòng | -6.687 | -8.10 | <0.01 | 2 |
| Nhiệt độ cột | 0.191 | 0.22 | 0.824 | 6 |
| Nhiệt độ phun sương （°C） | 5.342 | 6.29 | <0.01 | 3 |
| Nhiệt độ bay hơi （°C） | 4.135 | 4.87 | <0.01 | 4 |
| Nhiệt độ phát hiện (°C) | 0.171 | 0.21 | 0.842 | 7 |
| Tốc độ dòng khí （SLM） | -10.381 | -12.23 | <0.01 | 1 |
| Bù sau cột | -2.559 | -3.02 | <0.01 | 5 |
Như có thể thấy từ Bảng 3, tốc độ dòng khí, tốc độ dòng pha động và bù sau cột cho thấy các tác động tiêu cực. Cụ thể, việc giảm tốc độ dòng khí và tốc độ dòng pha động, cùng với việc vô hiệu hóa bù sau cột, có thể làm tăng đáp ứng đỉnh sắc ký. Tuy nhiên, việc giảm tốc độ dòng pha động có thể dẫn đến tăng độ rộng đỉnh và giảm độ nhạy phát hiện. Do đó, tốc độ dòng được duy trì phù hợp với phương pháp tiêu chuẩn. Trong khi nhiệt độ cột và nhiệt độ phát hiện thể hiện các tác động tích cực, chúng không làm tăng đáng kể giá trị đáp ứng. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa tốc độ dòng khí, nhiệt độ phun sương và nhiệt độ bay hơi.
Ảnh hưởng của tốc độ dòng khí, nhiệt độ phun sương và nhiệt độ bay hơi đến giá trị đáp ứng đã được điều tra bằng cách sử dụng thiết kế thí nghiệm Box-Behnken trong khuôn khổ phương pháp luận bề mặt đáp ứng. Thiết kế thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4.
Bảng 4 Thiết kế thí nghiệm Box-Behnken
| Số | Tốc độ dòng khí (SLM) | Nhiệt độ phun sương （°C） | Nhiệt độ bay hơi （°C） |
| 1 | 0.15 | 75 | 80 |
| 2 | 0.15 | 85 | 80 |
| 3 | 0.25 | 75 | 80 |
| 4 | 0.25 | 85 | 80 |
| 5 | 0.15 | 80 | 75 |
| 6 | 0.15 | 80 | 85 |
| 7 | 0.25 | 80 | 75 |
| 8 | 0.25 | 80 | 85 |
| 9 | 0.2 | 75 | 75 |
| 10 | 0.2 | 75 | 85 |
| 11 | 0.2 | 85 | 75 |
| 12 | 0.2 | 85 | 85 |
| 13 | 0.2 | 80 | 80 |
Các điều kiện phát hiện spectinomycin hydrochloride được xác định bằng cách mô phỏng sự thay đổi diện tích đỉnh bằng cách sử dụng phương pháp luận bề mặt đáp ứng (Hình 2) và xem xét các phạm vi thông số của thiết bị: nhiệt độ phun sương 85°C, nhiệt độ bay hơi 80°C, nhiệt độ máy dò 50°C và tốc độ dòng khí 0.2 SLM.
A. Ảnh hưởng của tốc độ dòng khí và nhiệt độ bay hơi đến diện tích đỉnh
B. Ảnh hưởng của tốc độ dòng khí và nhiệt độ phun sương đến diện tích đỉnh
C. Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sương và nhiệt độ bay hơi đến diện tích đỉnh
Hình 2 Sự thay đổi diện tích đỉnh
Độ chính xác khi tiêm
Dung dịch gốc spectinomycin hydrochloride được pha loãng đến 0.35mg/mL và sáu lần tiêm liên tiếp được thực hiện theo các điều kiện sắc ký đã chỉ định với sắc ký đồ được ghi lại. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của thời gian lưu và diện tích đỉnh cho đỉnh sắc ký spectinomycin hydrochloride đã được tính toán. Kết quả được hiển thị trong Bảng 5.
Bảng 5 Kết quả kiểm tra độ chính xác khi tiêm
| Số | Thời gian lưu (phút) | Diện tích đỉnh (SU*s) |
| 1 | 7.625 | 259.124 |
| 2 | 7.615 | 245.223 |
| 3 | 7.618 | 270.250 |
| 4 | 7.608 | 237.267 |
| 5 | 7.627 | 254.977 |
| 6 | 7.613 | 255.548 |
| RSD (%) | 0.09 | 4.49 |
Tính đặc hiệu
Theo hướng dẫn ICH Q2(R2) về xác nhận quy trình phân tích và Chương chung Dược điển Trung Quốc 〈9101〉 Hướng dẫn về xác nhận phương pháp phân tích, phương pháp tối ưu hóa đã được xác nhận về tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ lặp lại.
Nước tinh khiết và dung dịch mẫu (0.35 mg/mL) được phân tích song song với sắc ký đồ được ghi lại. Kết quả (Hình 3) cho thấy không có đỉnh sắc ký tại thời gian lưu của spectinomycin hydrochloride trong sắc ký đồ nước tinh khiết, trong khi đỉnh của spectinomycin hydrochloride trong dung dịch mẫu đạt được sự phân tách đường cơ sở khỏi các đỉnh liền kề (R > 1.5).
Hình 3 Kết quả phân tích mẫu Spectinomycin Hydrochloride (0.35mg/mL)
Khoảng tuyến tính
Chuẩn bị ba mẫu song song của dung dịch gốc spectinomycin hydrochloride theo phương pháp chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn, phân tích chúng theo các điều kiện sắc ký và ghi lại sắc ký đồ. Thực hiện phân tích hồi quy bằng cách sử dụng diện tích đỉnh sắc ký và nồng độ tương ứng.
Hình 4 Kết quả kiểm tra độ tuyến tính (Đã biến đổi log so với chưa biến đổi)
Theo tài liệu, mối quan hệ giữa giá trị đáp ứng ELSD và nồng độ là phi tuyến tính, yêu cầu biến đổi logarit cả giá trị đáp ứng và nồng độ trước khi thực hiện phân tích hồi quy [8,9,10]. Sau khi áp dụng phép biến đổi logarit cho dữ liệu thực nghiệm, hệ số tương quan của đường hồi quy tuyến tính vượt quá 0.999, tốt hơn đáng kể so với kết quả thu được mà không cần biến đổi logarit (như thể hiện trong Hình 4).
Độ chính xác và độ lặp lại
Dung dịch gốc spectinomycin hydrochloride được pha loãng đến nồng độ 0.25, 0.35 và 0.50mg/mL. Đối với mỗi nồng độ, ba mẫu song song đã được chuẩn bị, phân tích theo các điều kiện sắc ký đã chỉ định và sắc ký đồ đã được ghi lại. Hàm lượng được tính bằng đường cong hồi quy và độ thu hồi và độ lặp lại đã được đánh giá. Kết quả được trình bày trong Bảng 6.
Bảng 6 Kết quả kiểm tra độ thu hồi
| Số | Giá trị thực tế (mg/Ml) | Giá trị tính toán (mg/Ml) | Độ thu hồi (%) | RSD độ thu hồi (%) |
| 1 | 0.25 | 0.252 | 100.8 |
1.36 |
| 2 | 0.25 | 0.251 | 100.4 | |
| 3 | 0.25 | 0.246 | 98.4 | |
| 4 | 0.35 | 0.348 | 99.4 | |
| 5 | 0.35 | 0.352 | 100.6 | |
| 6 | 0.35 | 0.344 | 98.3 | |
| 7 | 0.50 | 0.505 | 101.0 | |
| 8 | 0.50 | 0.513 | 102.6 | |
| 9 | 0.50 | 0.504 | 100.8 |
Giới hạn định lượng (LOQ)
Pha loãng dung dịch gốc streptomycin hydrochloride đến nồng độ 12μg/mL. Phân tích mẫu theo các điều kiện sắc ký và ghi lại sắc ký đồ. Tính tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm (S/N) của đỉnh sắc ký streptomycin hydrochloride và xác định độ lặp lại của nó. Kết quả được hiển thị trong Bảng 7.
Bảng 7 Kết quả kiểm tra LOQ
| Số | SNR | Diện tích đỉnh (SU*s) | RSD diện tích đỉnh (%) |
| 1 | 15.647 | 3.416 |
8.45 |
| 2 | 10.634 | 2.928 | |
| 3 | 15.728 | 3.145 | |
| 4 | 12.842 | 3.529 | |
| 5 | 14.662 | 3.396 | |
| 6 | 11.076 | 3.730 |
Kết quả cho thấy rằng theo yêu cầu hướng dẫn ICH về S/N > 10, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích đỉnh đối với nồng độ dung dịch spectinomycin hydrochloride này đáp ứng các tiêu chí. Do đó, nó có thể đóng vai trò là tiêu chuẩn giới hạn định lượng cho spectinomycin hydrochloride.
5. Kết luận
Dựa trên phương pháp dược điển, nghiên cứu này đã thiết lập một quy trình phân tích đáng tin cậy và mạnh mẽ để định lượng spectinomycin hydrochloride. Các điều kiện của máy dò tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) đã được tối ưu hóa một cách có hệ thống. Phương pháp tối ưu hóa đã chứng minh sự ổn định và chính xác được cải thiện, độ nhạy phát hiện cao hơn và khoảng tuyến tính đạt yêu cầu.
Máy dò ELSD3260 là một máy dò dòng chia, nhiệt độ thấp, được thiết kế và phát triển mới. Nó phù hợp để phân tích cả các chất không bay hơi và bán bay hơi, cung cấp một giải pháp thay thế có giá trị cho các hợp chất không có khả năng hấp thụ UV. Trong nghiên cứu này, việc sử dụng ELSD3260 để phân tích spectinomycin hydrochloride đã mang lại các giá trị đáp ứng và độ lặp lại tuyệt vời, cùng với việc tăng cường độ nhạy phát hiện. Những phát hiện này chứng minh rằng thiết bị này rất phù hợp để phân tích định lượng spectinomycin hydrochloride.
Gửi yêu cầu của bạn trực tiếp đến chúng tôi
